蛋白提取定量

♦ 服务介绍

       蛋白提取是做WB的必要提取步骤。主要是将组织或细胞的蛋白分离提取出来，以便后续做WB检测。蛋白提取主要可以提取：总蛋白、胞浆/胞核蛋白、线粒体蛋白、膜蛋白。

♦ 实验流程

       编号核对-组织取块-组织匀浆-离心-蛋白定量-蛋白变性

♦ 实验样品要求

       （1）细胞不少于5×106个；

       （2）组织样品不少于50mg；

       （3）总蛋白浓度不低于 2μg/μl（至少50μl）；

♦ 注意事项

       （1）每张膜上做一种目的蛋白和相应的内参蛋白。每张膜上可以做8个样品。一般状况下，2周即可完成实验。如遇特殊情况，如一抗不好，蛋白浓度低或蛋白特殊，如分子量大等，周期会有所延长。

       （2）Western Blot细胞蛋白样本的准备及运输：去掉培养液，用PBS洗一次后，加入少量PBS，用细胞刮将细胞刮下，用1ml枪吸取细胞易于1.5ml EP管中，快速离心（升至最高转速就可stop）去除上清后，可按下面两种方法运输：A.细胞干运输：将细胞干放入液氮速冻，-80℃保存; 如需长途过夜运输，建议干冰运输；如当天送达样本，可用液氮或者-80℃冰袋运输；B.细胞裂解液运输：加入一定量的胞裂解液后即可冷藏运输（冰袋或者冰盒）。如需检测磷酸化蛋白，建议裂解液中加入终浓度1mM的NaF，NaF可抑制磷酸酶活性，保护蛋白磷酸化水平。如果加入裂解液后提取蛋白，则置于冰上裂解1 h，12000rpm离心10 min后取上清，即为蛋白样本。蛋白样本可-20度冷藏运输（建议快递寄送用干冰或者足量-80度冰袋），保存需要-80℃。

       （3）蛋白样本运输：蛋白样本需要经过浓度测定，再进行变性，变性时先加入Sample buffer，再95℃ 10 min，Sample buffer可防止变性导致的蛋白沉淀析出。变性的蛋白可直接冷藏运输，-20℃稳定保存。