不同类型的培养基制备程序也不同，主要可分为：配料、溶化、矫正pH、澄清过滤、分装、灭菌及检定8个步骤。
1，配料：按培养基处方准确称取各种成分，先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，再加入各种成分，以防蛋白胨等粘附于瓶底，然后再以剩余的水冲洗瓶壁。
2，溶化：将各种成分混匀于水中，最好以流通蒸气溶化半小时，如在电炉上溶化应随时搅拌，如有琼脂成分时更应注意防止外溢。溶化完毕，补足失去的水分。
3，矫正pH：pH测定，取与标准管同口径的试管（通常用华氏试管）3支，于第1、3管各加入欲测定pH的的培养基5ml，并于第一管中加入0.2g／L的酚红0.25ml作为测定管，混匀医学|教育网搜集整理；于第2管加入蒸馏水5ml，第4管为pH标准比色管。 pH的校正，若测定管过酸或过碱可用0.1mol／L氢氧化钠或0.1mol／L盐酸溶液矫正，直至颜色与标准管相同为止，加碱或加酸时要精确缓慢，每加1滴后要充分混匀，比色后再加第2滴（有时仅加半滴）准确记录加入的量。 计算，设5ml培养基矫正pH至7.4时需0.1mol／L氢氧化钠0.15ml，现有培养基4990ml，需加氢氧化钠的量可按下列方法计算：5∶4990＝0.15∶X X＝0.15×4990/5＝149.7（ml），如将此0.1mol／L的氢氧化钠改用1mol／L的氢氧化钠时，则需14.9ml即可。
4，过滤澄清：培养基配制后一般都有沉渣或混浊出现，需过滤成清晰透明后方可使用，常用的过滤方法如下：
液体培养基必须清晰，以便观察细菌的生长情况，常用滤纸过滤，亦可在加热前加入用水稀释的鸡蛋白（1000ml培养基用1个鸡蛋白）在100℃加热后保持60～70℃40～60分钟，使其不溶性物质附于凝固的蛋白上而沉淀，然后再用虹吸法吸出上清液或以滤纸过滤。固体培养基如系琼脂培养基，于加热融化后需趁热以绒布或两层纱布中夹脱脂棉过滤；亦可用
自然沉淀法，即将琼脂培养基盛人铝锅或广口搪瓷容器内，以高压（103.43kPa）蒸汽融化15分钟后，静置高压锅内过夜，次日将琼脂倾出，用刀将底部沉渣切去，再融化即可收清晰的琼脂培养基。
5，分装：根据需要将培养基分装于不同容量的三角烧瓶、试管中。分装的量不宜超过容器的2／3以免灭菌时外溢。琼脂斜面分装量为试管容量的1／5，灭菌后须趁热放置成斜面，斜面长约为试管长的2／3。半固体培养基分装量约为试管长的1／3，灭菌后直立凝固待用。高层琼脂分装量约为试管的1／3，灭菌后趁热直立，待冷后凝固待用。液体培养基分装于试管中，约是试管长度的1／3。琼脂平板：将灭菌（或加热融化）后的培养基冷至50℃左右，以无菌手续倾人灭菌平皿内，内径9cm的平皿倾注培养基约13～15ml，轻摇平皿底医学|教育网搜集整理，使培养基平铺于平皿底部，待凝固后即成，倾注时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌落入。新制成的平板培养基（简称平板），表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将平皿倒扣搁置于37℃培养箱内约30分钟待平板平面干燥后使用。
6，灭菌：不同成分、性质的培养基，可采用不同的灭菌方法。高压蒸汽灭菌法：高压灭菌的温度与时间随种类及数量的不同有所差别，一般少量分装时高压（103.43kPa）灭菌15分钟即可，分装量较大时，可高压（103.43kPa）灭菌30分钟，含糖的培养基高压（55.16kPa）灭菌15分钟。以免糖类被破坏。
7，检定：每批制成后须经检定方可使用，检定时将培养基放37℃温箱内培养24小时后，证明无菌，同时用已知菌种检查在此培养基上生长繁殖及生化反应情况，符合要求者方可使用。
8，保存：制好的培养基，不宜保存过久，以少量勤做为宜。每批应注明名称，分装量，制作日期等，放在4℃冰箱内备用。
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