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碧云天生产的Phosphate Sensor Assay Kit (磷酸根荧光检测试剂盒)，也称磷酸根传感器检测试剂盒或Phosphate Fluorescent Assay Kit，是一种采用荧光基团标记的重组磷酸根结合蛋白，从而可以超高灵敏度检测溶液中的无机磷酸根或ATP酶(ATPase)、GTP酶(GTPase)，磷酸酶(phosphatase)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase)等酶活性的荧光检测试剂盒。

本产品对于无机磷酸根(PO₄^3-)的检测灵敏度可以低至100nM。不仅适用于直接检测无机磷酸根的浓度，也被广泛用于检测能够直接或间接催化产生无机磷酸根的ATPase，GTPase，phosphatase和phosphodiesterase等酶的活性。

Phosphate Sensor是大肠杆菌(E.coli)磷酸根结合蛋白(phosphate-binding protein) A197C突变体重组蛋白用环境敏感型荧光基团MDCC (N-[2-(1-Maleimidyl)ethyl]-7-(diethylamino)coumarin-3-carboxamide)进行化学标记的产物。该无机磷酸根荧光探针(phosphate fluorescent probe)对无机磷酸根高度敏感，能和无机磷酸根快速并紧密(K_d~0.1μM)结合。无机磷酸根的结合会引起该传感器蛋白发生明显的构象变化，并导致荧光强度的明显增强。因此该荧光探针可以用于快速、超高灵敏度对溶液中的无机磷酸根进行实时动力学检测。

Phosphate Sensor与无机磷酸根结合后荧光信号显著增强。激发光波长为430nm，发射光波长为450nm的条件下，Phosphate Sensor与无机磷酸根结合后荧光信号增强最为显著，荧光信号升高约9倍(图1)。

图1. Phosphate Sensor Assay Kit (磷酸根荧光检测试剂盒)中Phosphate Sensor结合无机磷酸根前后的荧光信号差异。检测体系(20μl): 5μM Phosphate Sensor, 0或1mM Phosphate Standard，1X检测缓冲液。依次将10μl 0或2mM Phosphate Standard和10μl 10μM Phosphate Sensor加入384孔黑板(具体浓度的Phosphate Standard和Phosphate Sensor均由本试剂盒提供的试剂经1X检测缓冲液稀释获得)。采用荧光酶标仪在25℃ 430nm激发光条件下进行不同发射光波长的荧光测定，每组实验体系重复三次并取平均值。当反应体系中不加入无机磷酸根时，Phosphate Sensor在430nm激发光条件下的最大发射波长约为474nm；当反应体系中加入无机磷酸根时，Phosphate Sensor在430nm激发光条件下的最大发射波长约为465nm (图1A)。当激发光/发射光分别为430nm/450nm时，Phosphate Sensor在无机磷酸根结合前后的荧光信号差异最显著(图1B)。

本产品检测无机磷酸根的敏感范围约在100nM-5μM之间(图2)，比传统的孔雀绿磷酸根检测法(Malachite green phosphate assay)敏感约100倍以上。

Phosphate Sensor对溶液中浓度低至100nM的无机磷酸根的结合即可导致明显的荧光增强，实测的EC₅₀约为1.7μM (图2)，不同检测条件的检测数据会略有差异。

图2. Phosphate Sensor Assay Kit (磷酸根荧光检测试剂盒)中Phosphate Sensor结合无机磷酸根的标准曲线。检测体系(20μl): 5μM Phosphate Sensor，1X检测缓冲液，0-1mM Phosphate Standard。依次将10μl 0-2mM Phosphate Standard和10μl 10μM Phosphate Sensor加入384孔黑板(具体浓度的Phosphate Standard和Phosphate Sensor均由本试剂盒提供的试剂经1X检测缓冲液稀释获得)。采用荧光酶标仪在25℃激发光/发射光波长分别为430nm/450nm条件下进行荧光测定，每组实验体系重复三次。利用GraphPad Prism软件中的“variable slope”模型[Y=Bottom+Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))]拟合出标准曲线。不同实验条件的检测数据会略有差异，图中数据仅供参考。

用途：无机磷酸根浓度的超灵敏度荧光检测，ATP酶(ATPase)、GTP酶(GTPase)、磷酸酶(Phosphatase)和磷酸二酯酶(Phosphodiesterase)等可以直接或间接催化产生无机磷酸根的酶的高灵敏度活性检测。

Phosphate Sensor来源：MDCC荧光标记的E.coli表达的重组蛋白，表达基因为E.coli phoS基因A197C突变体。

本产品在检测过程中操作简单，使用方便，通常10-30个样品可以在30-60分钟内测定完毕。

一个小包装或中包装的本产品，其中分别含有20nmol或100nmol的Phosphate Sensor，如果用于20μl检测体系，通常分别可以进行200或1000次检测。

包装清单：    

保存条件：  
   

-20℃避光保存，至少一年有效。

注意事项：  
   

由于Phosphate Sensor储存液中含有高浓度甘油，为减小操作误差，建议根据每次实验所需的量预先用1X检测缓冲液将一定量的Phosphate Sensor稀释成10μM或其它合适浓度备用。

使用荧光酶标仪检测时，为避免相邻孔之间的荧光信号干扰，推荐使用孔和孔之间不透光的384孔黑板。

某些表面有涂层的多孔板可能含有无机磷酸根，容易干扰检测体系。因此，建议使用表面未加涂层的384孔黑板进行检测。

由于不同荧光检测设备的灵敏度有所差异，实际检测过程中可以根据荧光信号的强弱适当调整检测体系中Phosphate Sensor的终浓度。

检测体系中须注意避免引入气泡，可以在检测之前对检测板进行离心或震荡处理。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：    
    1.样品中无机磷酸根浓度的精确测定：    
a.试剂的准备。    
根据样品和标准品的数量，溶解10X检测缓冲液，用水配制适量的1X检测缓冲液。按照每个样品或标准品需要5μl 10μM Phosphate Sensor量，用1X检测缓冲液配制适量的10μM Phosphate Sensor。1X检测缓冲液配制后可以冻存并用于后续使用，10μM Phosphate Sensor配制后宜4℃或冰浴保存，并在当日使用，不宜冻存并用于后续使用。Phosphate Sensor的最佳浓度可根据实际检测效果进行适当调整。    
b.标准品的准备。    
取适量Phosphate Standard (10mM)，用1X检测缓冲液稀释成不同浓度的标准品，例如2mM、1mM、0.5mM、0.25mM、0.125mM、62.5μM、31.3μM、15.6μM、7.8μM……3.9μM、1.95μM、0μM。标准品的浓度范围和浓度点可以根据实际检测效果适当调整。    
c.样品的准备。    
对于待检测的样品，根据预测的样品中的无机磷酸根的浓度，用1X检测缓冲液将样品稀释至无机磷酸根的浓度约在200nM-2μM范围，每个样品的体积不少于10μl。    
d.标准品和样品的检测。    
(a)参考下表设置反应体系。使用384孔黑板，先加入10μl 10μM Phosphate Sensor，再加入10μl不同浓度的上述Phosphate Standard溶液或待检测的样品，充分混匀后进行荧光测定。检测条件为25℃，激发光/发射光=430nm/450nm。为减小误差，每组实验体系最好能重复三次。    
   

(b)利用GraphPad Prism软件中的“variable slope”模型[Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))]拟合出标准曲线，拟合之前需先将Phosphate浓度“X”转换成“log(X)”。根据标准曲线计算出样品中的无机磷酸根的浓度。    
    2.样品中催化生成无机磷酸根的酶活性检测。    
a.终点法酶活性检测。    
(a)参考文献资料，针对具体的酶，例如ATPase，GTPase，Phosphatase和phosphodiesterase等设置相应的酶反应体系。    
(b)反应结束后，参考上述步骤1c，用1X检测缓冲液稀释样品至无机磷酸根浓度约在200nM-2μM范围，每个样品的体积不少于10μl。    
(c)同上述步骤1，设置标准曲线，并进行标准品和样品的检测。    
(d)根据样品和对照中检测出的无机磷酸根的浓度，和相应的酶活性定义，计算出样品中的酶活性。如果有必要可以检测样品的蛋白浓度，以计算出单位蛋白含量样品中的酶活性。    
b.酶活性的动力学检测。    
(a)参考文献资料，针对具体的酶，例如ATPase，GTPase，Phosphatase和phosphodiesterase等规划相应的酶反应体系。推荐反应体系的最终体积为20μl，并在384孔黑板中进行反应。    
(b)在酶反应体系中加入Phosphate Sensor至终浓度为5μM。    
(c)加入ATPase等酶的关键底物起始酶反应。    
(d)每间隔适当时间进行荧光检测，激发光/发射光=430nm/450nm。    
(e)根据样品和对照在不同时间点的荧光读数，以及参考步骤1进行的标准曲线检测结果，计算出在单位时间内样品中酶催化产生的无机磷酸根的量。然后再根据酶的活性定义，计算出样品中酶活性。如果有必要可以检测样品的蛋白浓度，以计算出单位蛋白含量样品中的酶活性。