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Product Brief

• 产品概况

  产品货号	MK1014-100
  产品名称	TUNEL细胞凋亡两步法检测试剂盒-AP（100T）
  保存条件	-20℃冷冻保存，一年有效。
  工作原理	在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3’-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl Transferase）可以将生物素标记的dUTP（BIO-dUTP）标记至3’-OH末端，BIO-dUTP结合在DNA断点部位，再结合链酶亲和素-AP（SABC-AP），BCIP/NBT 予以显示。凋亡的细 胞核呈紫蓝色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。
  试剂盒内容	1. 标记缓冲液(Labeling Buffer)                         5ml 2. 末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20)                100μι 3. BIO-dUTP (×20)                                           100μι 4. 封闭液(Blocking Reagent)                            20ml 5. SABC-AP (× 100)                                         100μι 6. Proteinase K (×200)                                     250μι 7.SABC稀释液                                                   20ml 8.BCIP/NBT显色剂(×20)                                  1ml 9.阳性对照片                                                     2 张

  
  

  
  

  
  

Instructions

用户自备试剂

1.         多聚赖氨酸或APES(博士德公司有售)。

2.         0.01M TBS,PH7.5（AR0031博士德公司有售)(配法:1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris 和0.45—0.5ml纯乙酸。)

3.         0.01M TBS,pH9.0--9.5(配法:1L 双蒸馏水中加入 8.5 克氯化钠,1.2 克 Tris )。

4.         核固红—复染用(博士德公司有售AR0008)。

5.         水溶性封片剂(博士德公司有售AR1018)。

操作步骤

     1.        样品处理

   (1)      玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理。

(2)      细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)室温下固定30—60分钟。0.01M PBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤2分钟×2次。

(3)      组织：有条件时应及时固定。常规4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水（脱蜡务必干净）。

2.        标本片加0.01M TBS 1:200新鲜稀释Proteinase K 37℃消化1—15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10—60秒钟。新鲜石蜡切片消化5-10分钟。陈旧石蜡切片消化10-15分钟)。

3.         标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer) 20μl/片,以保持切片湿润。按每张切片取TdT 和BIO-d-UTP各1μl，加入18μl标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20μl/片。置样品于湿盒中，37℃标记2小时。

4.        0.01M TBS洗2分钟×3次。

5.       加封闭液50μl/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗。

6.       用SABC稀释液1：100稀释SABC-AP：取 1ml 抗体稀释液加 SABC-AP 10μl，混匀后 50μl/片加 至切片。37℃反应 60 分钟。0.01M TBS（pH7.5）洗 5 分钟×4 次。

7.       BCIP/NBT 显色：BCIP/NBT（×20）按 1：20 的比例用 0.01M TBS (pH9.0-9.5)稀释，混匀。显色 液加至标本上。避光显色 20-30 分钟，若无背景出现则可继续显色。充分水洗。

8.       必要时可用核固红等复染。水溶性封片剂（博士德有售）封片，也可简单地用甘油封片。镜检

结果判定

细胞核中有紫蓝色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。

注意事项

1.       试剂盒严格-20℃存放。

2.       初用时如试管底部无可见的试剂，在离心机离心 3 分钟，使试剂沉至管底。

3.       检测过程中切勿使样品干涸。

4.       BCIP/NBT 显色较慢，可适当延长显色时间。