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Product Brief

• 产品概况

  产品货号	MK1011
  产品名称	TUNEL细胞凋亡两步法检测试剂盒-POD（50T）
  保存条件	-20℃冷冻保存，一年有效。
  工作原理	在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3’-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl Transferase）可以将生物素标记的dUTP（BIO-dUTP）标记至3’-OH末端，BIO-dUTP结合在DNA断点部位，再结合链酶亲和素-过氧化物酶（SABC），然后加入显色底物DAB予以显示。凋亡的细胞核呈黄色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。
  试剂盒内容	1. 标记缓冲液(Labeling Buffer)                         3ml 2. 末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20)                50μι 3. BIO-dUTP (×20)                                           50μι 4. 封闭液(Blocking Reagent)                            10ml 5. SABC-POD (× 100)                                       50μι 6. Proteinase K (×200)                                     125μι 7.SABC稀释液                                                   10ml 8.阳性对照片                                                     2 张

  
  

  
  

Instructions

用户自备试剂

1.       多聚赖氨酸或APES(博士德公司有售)。

2.         0.01M TBS,PH7.5（AR0031博士德公司有售)(配法:1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris 和0.45—0.5ml纯乙酸。)

3.         DAB显色试剂盒（AR1027 博士德公司有售)，也可自配显色剂。

操作步骤

1.         样品处理

(1)      玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理。

(2)      细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)室温下固定30—60分钟。0.01M PBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤2分钟×2次。

(3)      组织：有条件时应及时固定。常规4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水（脱蜡务必干净）。

2.         新鲜配制3%H2O2，室温处理10分钟。蒸馏水洗涤2分钟×3次。

3.        标本片加0.01M TBS 1:200新鲜稀释Proteinase K 37℃消化1—15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10—60秒钟。新鲜石蜡切片消化5-10分钟。陈旧石蜡切片消化10-15分钟)。

4.  标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer) 20μl/片,以保持切片湿润。按每张切片取TdT 和BIO-d-UTP各1μl，加入18μl标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20μl/片。置样品于湿盒中，37℃标记2小时。

5.       0.01M TBS洗2分钟×3次。

6.       加封闭液50μl/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗。

7.       用SABC稀释液1：100稀释SABC：取1mlSABC稀释液加SABC 10μl，混匀后50μl/片加至切片。37℃反应30分钟。0.01M TBS洗5分钟×4次。

8.       DAB显色：取显色液B 1ml，显色液A 1滴（约为50ul），混匀。即配成 DAB 工作液。滴加DAB 工作液到切片上，覆盖住标本，一般显色时间为 1－10 分钟，请在显微镜下观察显色情况，若无背景出现则可继续显色。水洗终止显色。

9.       苏木素轻度复染。0.01M TBS洗，蒸馏水洗。脱水，透明，封片。显微镜观察。

结果判定

细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。

注意事项

1.试剂盒严格-20℃存放。

2.初用时如试管底部无可见的试剂，在离心机离心5分钟，使试剂沉至管底。

3.检测过程中切勿使样品干涸。