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Product Brief

• 产品概况

  产品货号	MK1017
  产品名称	TUNEL细胞凋亡检测试剂盒-AP（50T）
  保存条件	-20℃冷冻保存，一年有效。
  工作原理	在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3’-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase )可以将地高辛标记的dUTP (DIG-dUTP)标记至3’-OH末端，DIG-dUTP结合在DNA断点部位，可以通过生物素化抗地高辛抗体(Anti-DIG-Biotin)和SABC-AP反应后，加入显色底物BCIP/NBT予以显示。凋亡的细胞核呈紫蓝色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。
  试剂盒内容	1.标记缓冲液(Labeling Buffer)                       3ml 2.末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20)              50μl 3.DIG-dUTP(×20)                                          50μl 4.封闭液(Blocking Reagent)                          10ml 5.生物素化抗地高辛抗体(× 100)                     50μl 6.SABC-AP(×100)                                         50μl 7.Proteinase K (×200)                                  125μl 8.BCIP/NBT显色剂(×20)                                0.5ml 9.抗体稀释液                                                 10ml 10.阳性对照片2张

  
  

Instructions

用户自备试剂

1. 多聚赖氨酸或APES(博士德公司有售)。
2. 0. 01M TBS(pH7.5)(配法:1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris 和0.45—0.5ml纯
乙酸。)
3. 0.01M TBS,pH9.0-9.5(配法:1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris )。
4. 核固红—复染用。
5. 水溶性封片剂。

操作步骤

1. 样品处理
(1) 玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理。
(2) 细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0-7.6)室温下固定30—60分钟。PBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤2分钟×2次。
(3) 组织：应及时固定。常规4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0-7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水9脱蜡务必干净)。
2. 标本片加0. 01M TBS(pH7.5)1: 200新鲜稀释Proteinase K 37℃消化1-15分钟, TBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或仅消化10-60秒钟。新鲜石蜡切片消化5-10分钟。陈旧石蜡切片消化10-15分钟)。
3. 标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer),20μι/片,以保持切片湿润。然后按每张切片取TdT和DIG-dUTP各1μι，加入18μι标记缓冲液中，混匀，甩去切片上多余液体后加混合的标记液，20μι/片。置样品于湿盒中，37℃标记2小时。
4. 0. 01M TBS(pH7.5)洗2分钟×3次。
5. 加封闭液50μι/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗。
6. 用抗体稀释液1：100稀释生物素化抗地高辛抗体：(取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗 体10μι)，混匀后50μι/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应30-60分钟。0.01M TBS洗2分钟×3次。
7. 用抗体稀释液1：100稀释SABC-AP：取1ml抗体稀释液加SABC-AP 10μι，混匀后50μι/片加至切片。37℃反应60分钟。0.01M TBS洗5分钟×4次。
8. BCIP/NBT显色：BCIP/NBT (×20)按1：20的比例用0.01M TBS (pH9.0-9.5)稀释，混匀。显色液加至标本上。避光显色20-30分钟，若无背景出现则可继续显色。充分水洗。
必要时可用核固红等复染。水溶性封片剂(博士德有售)封片，也可简单地用甘油封片。镜检。

结果判定

细胞核中有紫蓝色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。

注意事项

1.试剂盒严格-20℃存放。
2.初用时如试管底部无可见的试剂，在离心机离心3分钟，使试剂沉至管底。
3.检测过程中切勿使样品干涸。
4.BCIP/NBT显色较慢，可适当延长显色时间。