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Product Brief

• 产品概况

  产品货号	MK1027
  产品名称	TUNEL细胞凋亡检测试剂盒-FITC（100T）
  保存条件	-20℃冷冻保存，一年有效。
  工作原理	在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3’-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl Transferase ）可以将地高辛标记的dUTP （DIG-dUTP）标记至3’-OH末端，DIG-dUTP结合在DNA断点部位，可以通过生物标记的抗地高辛抗体（Anti-DIG-Biotin）反应后，再结合链酶亲和素-荧光素FITC（SABC-FITC）。FITC在490-495nm激化，在520-530nm发射荧光，呈黄绿色。凋亡的细胞核呈黄绿色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。
  试剂盒内容	1. 标记缓冲液(Labeling Buffer)          5ml 2. 末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20) 100μι 3. DIG-dUTP (×20)                            100μι 4. 封闭液(Blocking Reagent)              20ml 5. 生物素化抗地高辛抗体(× 100)         100μι 6. SABC-FITC(×100)                           100μι 7. Proteinase K (×200)                       250μι 8. 抗体稀释液                                      20ml 9. 阳性对照片                                      2 张

  
  

Instructions

用户自备试剂

1. 多聚赖氨酸或APES(博士德公司有售)。

2. 0.01M TBS,PH7.5(配法:1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris 和0.45—0.5ml纯乙酸。)

3. DAPI染色液（货号AR1176，AR1177）

4. 水溶性封片剂或抗荧光衰减封片剂。

操作步骤

1. 样品处理

(1) 玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理。

(2) 细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)室温下固定30—60分钟。0.01M PBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤2分钟×2次。

(3) 组织：有条件时应及时固定。常规4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水（脱蜡务必干净）。

2. 标本片加0.01M TBS 1:200新鲜稀释Proteinase K 37℃消化1—15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10—60秒钟。新鲜石蜡切片消化5-10分钟。陈旧石蜡切片消化10-15分钟)。

3. 标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer) 20μι/片,以保持切片湿润。按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μι，加入18μι标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20μι/片。置样品于湿盒中，37℃标记2小时。

4. 0.01M TBS洗2分钟×3次。

5. 加封闭液50μι/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗。

6. 用抗体稀释液1：100稀释生物素化抗地高辛抗体：（取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μι），混匀后50μι/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应30分钟。0.01M TBS洗2分钟×3次。

7. 用抗体稀释液1：100稀释SABC：取1ml抗体稀释液加SABC 10μι，混匀后50μι/片加至切片。37℃反应30分钟。0.01M TBS洗5分钟×4次。

8. 必要时可用DAPI染色液（货号AR1176，AR1177）轻度复染，蒸馏水洗。抗荧光衰减封片剂封片(可用甘油代替)。荧光显微镜观察。

结果判定

细胞核中有黄绿色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。

注意事项

1. 试剂盒严格-20℃存放。

2. 初用时如试管底部无可见的试剂，在离心机离心5分钟，使试剂沉至管底。

3. 检测过程中切勿使样品干涸。